实验目的

检测凝结芽孢杆菌产品中的有效活菌数及杂菌数，同时罗列出操作过程中可能存在的各种问题，提醒操作人员在操作过程尽可能规范，减少误差。

灭菌空平皿，超净工作台，旋转式摇床，灭菌锅，振荡器，分析天平（万分之一），无菌试管，酒精灯，1mL移液器及枪头，10mL移液管，培养箱，厌氧罐。

MRS培养基配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，K2HPO4﹒3H2O2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠﹒3H2O5g，MgSO4﹒7H2O0.58g，MnSO4﹒4H2O0.25g，吐温mL，琼脂粉18g，CaCO35g，蒸馏水mL。℃灭菌30min备用。

北京陆桥MRS培养基成品，加CaCO35g/L，℃灭菌30min备用。

含氯化钠0.85%的生理盐水，称取氯化钠8.5g溶于mL蒸馏水中，℃高压灭菌15min备用。

1样品稀释

准确称取待测样品1.g，放入装有mL无菌生理盐水并放有小玻璃珠的mL三角瓶中，在旋转式摇床上室温rpm充分振荡30min，取出即成10-2稀释液；再用移液枪吸取1mL稀释液移入装有9mL无菌生理盐水的试管中，充分混匀即成10-3稀释液；更换枪头吸取10-3菌液移入装有9mL无菌生理盐水的试管中，即成10-4稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释梯度菌液。

2倾注

用移液器分别吸取不同稀释梯度菌液1mL，分别加至直径为9cm的无菌平皿中，用已冷却至50℃左右的MRS培养基倾注到以上平皿中，混匀。每个样品根据菌量不同取2-3个相邻适宜的稀释梯度，每个梯度3个平行。

3培养

待培养基凝固后，倒置放入厌氧罐中，加入厌氧袋，37℃培养48±2h。

4菌落特征及鉴别

培养48±2h后，观察菌落形态，凝结菌落为白色，边缘产生透明的溶钙圈。挑取菌落，结晶紫染色，显微镜下观察为长杆状。

5菌落计数

有效活菌数（CFU/g）=有效菌落平均数×稀释倍数。

杂菌率

目标菌以外的菌视为杂菌，对凝结芽孢杆菌计数的同时对杂菌进行计数。

杂菌率（%）=杂菌数/（凝结芽孢杆菌菌数+杂菌数）×%

1）称量过程中，每个样品一个称量纸，避免交叉污染，尤其是前一个样品是高菌量的枯草、地衣等芽孢菌类，如果称量纸上有少量残留会影响凝结芽孢杆菌的计数；

2）试验开始前，超净台紫外杀菌30min；

3）超净台洁净，试验所用平皿、试管、枪头、生理盐水等需严格高压灭菌，烘箱烘干后使用；

4）操作过程中选用10mL移液管，不要用5mL枪，枪如果不及时校准会有较大误差；

5）操作过程中选用灭菌好的生理盐水；

6）倾注时，MRS培养基不易过热，一般46-50℃为宜，但也不能温度太低，温度太低会导致稀释菌液和培养基混不均匀；

7）倾注混合过程中，保证稀释菌液与培养基充分混匀；

8）培养时，厌氧罐+厌氧袋方式培养最好，这样可避免一些芽孢类杂菌的干扰；

9）试验中，同时做空白对照（只加生理盐水不加菌），检测操作环境中的粪肠球菌等乳酸菌类杂菌的干扰情况。

凝结芽孢杆菌的检测方法目前没有国家统一标准，行业内有团体标准，方法各有千秋。本文借鉴GB.35-《食品安全国家标准食品微生物检测乳酸菌检验》的方法，因为凝结芽孢杆菌属于乳酸菌类，在年《伯杰氏古菌与细菌系统学手册》和最新书籍《乳酸菌科学与技术》（陈卫主编）均有描述。望本文能为从事凝结芽孢杆菌的业内人士提供一定参考。

作者：冯海霞

完

往期精彩推荐

根

源

替

抗

替抗·基础

·让我们认识真·耐热乳酸菌！

·葡萄糖氧化酶对有害菌的抑制试验

·枯草芽孢杆菌三个不同亚种萌发差异初探

替抗·技术

·丁酸梭菌对动物致病菌的拮抗作用研究

·枯草、地衣和丁酸梭状芽孢杆菌性能评估试验

·涨知识

溶菌酶抑菌机制与应用

替抗·应用

·肠康健替抗专题

肠康健在肉鸭现场应用案例

·肠康健替抗专题禾新盛肉鸡替抗试验

·丁酸梭菌在养殖业中的应用效果

替抗·大咖

·后抗生素时代微生态制剂创新展望-倪学勤教授

·商品肉禽减抗实践-许毅博士

·新常态下微生态产品研发及应用策略-张大伟博士

·固体发酵技术在后抗时代的应用-王文博博士

·酶制剂在后抗时代的应用-周莉芬博士

替抗·行业

·绿养先踪-肠康健对断奶仔猪生产性能的影响

·绿养先踪-肠康健对白羽肉鸡生产性能的影响

·以微掣微，科学替抗，这5家公司各有奇思妙招

知

源

汇

体验之旅

·南农朱伟云教授团队莅临根源集团指导交流

·天邦股份莅临根源集团参观交流

·嘉吉养殖板块考察团参观根源生物平度基地

知新之旅

·生物原料新产品技术推广会沈阳站

·生物原料新产品技术推广会烟台站

·江苏兴化老圩养殖技术交流研讨会

革新之旅

·南农·根源研究院奖学金颁奖仪式

暨南农·根源研究院续约仪式成功举办

·第四届太阳鸟·营养与创新大会盛大召开

·南农·根源研究院“年消化道分子

微生态国际研讨会”成功举办

掘知之旅

·第5期

新加坡“以爱为帆携手远航”主题培训圆满结业

·第4期

新加坡“以爱为帆携手远航”主题培训圆满结业

·第3期

日本“工匠精神与极致传承”主题培训圆满结业

扫码